1. 分子身份卡

• 符號：CCL4

• 別名：MIP-1β（Macrophage Inflammatory Protein-1 beta）

• UniProt ID：P13236

• 基因坐標：人類 17q12，小鼠 11D

• cDNA 長度：291 bp（編碼區）

• pre-pro 肽：109 aa

• 成熟分泌肽：69 aa（剪切位點 Ala24-Leu25）

• 理論分子量：7.8 kDa（還原態 SDS-PAGE 實測約 8–10 kDa，糖基化后 11–13 kDa）

2. 三維結構參數

• 折疊模式：CC 趨化因子特征性 β1-β2-β3 三股反平行 β 片層，覆蓋 C 端 α 螺旋

• 二硫鍵：Cys33-Cys75、Cys34-Cys58（絕對保守，決定構象穩定性）

• 寡聚態：生理濃度下傾向形成無活性同源二聚體；低 pH 或高鹽條件解離為活性單體

• 受體結合面：N-loop（Glu26-His33）與 40s 區（Lys45-His49）共同構成 CCR5 結合熱點，KD 2.3 nM（SPR 實測）

3. 表達譜與分泌動力學

• 主要源頭：CD8? T 細胞、巨噬細胞、NK 細胞、γδT 細胞、血小板

• 刺激窗口：TLR2/4/7 激動劑、IFN-γ、TCR 交聯后 2 h 可見 mRNA 峰值，4–6 h 蛋白釋放達 200–800 pg/10? 細胞

• 半衰期：血清 15 min（小鼠），肺泡灌洗液 45 min；與糖胺聚糖結合后局部組織半衰期延長至 2 h

4. 生物活性定量

• 趨化指數：對 CCR5? CD8? T 細胞 1 nM 出現顯著遷移，最大效應 10 nM（Transwell 體系）

• Ca2? 流：CCR5-CHO 報告細胞，EC?? 3.8 nM；信號持續 60–90 s

• HIV-1 抑制實驗：實驗室適應株 SF162，IC?? 50 ng/mL（約 6.4 nM）

5. 批間一致性控制

• 內毒素：≤0.1 EU/μg（重組 E.coli 來源，LAL 法）

• 純度：≥98 %（RP-HPLC，220 nm）；SDS-PAGE 單一條帶；質譜驗證分子量 ±0.1 %

• 生物比活：≥5×10? U/mg（以人 CCR5? T 細胞趨化實驗標定，內部參考品校準）

6. 穩定性與存儲

• 凍干品：4 °C 惰性氣體封存，24 個月活性損失 <5 %

• 液體：PBS+0.1 % CHAPS，–80 °C 分裝，避免反復凍融；3 次循環活性下降 8–12 %

• 溫度敏感點：37 °C 放置 72 h 后單體比例下降 30 %，二聚體增加，趨化活性降低 15 %

7. 檢測平臺參數

• ELISA 靈敏度：2.4 pg/mL（R&D DuoSet），線性范圍 7.8–500 pg/mL

• Luminex 多因子：Milliplex MAP，交叉反應 <0.5 %，與 CCL3、CCL5 無串擾

• 單細胞分泌：微孔編碼芯片（Isoplexis），檢測閾值 0.8 分子/小時/細胞

8. 工程改造熱點

• L3K突變：破壞二聚界面，單體化后趨化活性提高 2.3 倍，血清半衰期縮短 40 %

• C-terminal PEG5k：體內 t? 延長至 3 h，HIV 抑制 IC?? 降低 5 倍，但趨化活性下降 30 %

• [R47A] 變體：保留 CCR5 拮抗能力，消除募集 T 細胞副作用，用于 HIV 進入抑制劑開發

9. 與受體相互作用的晶體學坐標

• PDB 條目：5UIW（CCL4-CCR5 復合物），分辨率 2.9 ?

• 界面面積：1,140 ?2，氫鍵 8 對，鹽橋 3 對；水介導相互作用 4 處

• 熱點殘基：Asn22、Arg47、Glu66 突變后結合自由能變化 ΔΔG >3 kcal/mol

10. 實驗設計常用濃度窗口

• 體外趨化：梯度 0.1–100 nM，最佳 10 nM

• 小鼠腹腔炎模型：單次 500 ng/200 μL，4 h 后巨噬細胞浸潤峰值 1.2×10? 細胞/mL

• HIV 挑戰：預處理 100 ng/mL，30 min 后病毒加入，保護率 >90 %（R5 毒株）