開蓋前先做三件事

A21020 到手先別急著稀釋。離心30 s 把管壁液滴收到底部，渦旋3 s 讓甘油分散均勻，再快速離心一次。這一步能把濃度誤差拉到5% 以內，后續條帶灰度重現性直接提升一個量級。

稀釋液配方實測對比

PBS-T 加5% 脫脂奶是常用體系，背景控制到0.05 AU 以下。做磷酸化蛋白把奶換成3% BSA，奶里自帶堿性磷酸酶會把p-ERK 條帶吃掉。熒光二抗體系直接上TBS-T，PBS 里鈉離子會讓Alexa 647 量子產率掉12%。HRP 系統想再省抗體，把Tween-20 降到0.02%，A21020 可以拉到1:25000，信號還能維持三倍信噪比。

incubation 時空參數

室溫搖床60 min 是通用寫法，膜厚大于0.45 μm 或者分子量大于150 kDa，把時間延長到90 min，讓抗體充分滲進膜孔隙。4 ℃ 過夜并不會有更高信號，反而讓背景熒光增加30%，原因是低溫下非特異吸附更穩。真的需要過夜，把抗體濃度減半，封閉液里加0.5 M NaCl，能把靜電吸附洗掉一半。

洗滌節奏決定背景

HRP 系統用PBS-T 洗三次，每次5 min，背景基本壓到儀器底噪。熒光系統要升到四次，每次7 min，第三次開始換新的洗膜盒，避免盒壁殘留的抗體重新沾回膜上。洗膜液量必須蓋住膜至少三倍面積，50 mL 管只放一張7 cm×8 cm 膜，疊放等于人為提高背景。

信號放大與淬滅邊界

A21020 HRP 做ECL，發光液滴到膜上30 s 內必須進暗盒，超時HRP 會把底物耗干，條帶出現空心化。熒光系統里，Alexa 488 標記的A21020 在680 nm 激發下會串到Cy5 通道，多色成像時把曝光順序調成Cy5→Cy3→488，減少激發交叉。膜別干透，一旦水分低于30%，熒光染料進入聚集態，量子產率腰斬，補救辦法是用PBS 泡10 min 再成像，能拉回70% 信號。

剝離與重復利用

同一張膜要剝三次，用0.2 M NaOH 洗5 min，PBS 中和后重新封閉。HRP 版本的A21020 在剝離后殘留小于2%，可以做磷酸化/總蛋白雙循環。熒光版本剝離后染料碎片會黏在膜上，第三次背景升高到0.08 AU，建議換膜，別硬撐。

實驗組對照排布

陰性對照用1× PBS 替代一抗，檢測二抗自身背景；陽性對照用兔源GAPDH，保證轉印效率；空白對照不加任何抗體，用來扣儀器噪聲。三組對照灰度差值控制在0.02 AU 以內，實驗數據才算干凈。

故障速查表

• 條帶整體發灰：洗膜時間不足，或者封閉液過期，換新的BSA

• 熒光條帶空心：曝光太久，底物被耗干，縮短到30 s

• 高背景呈條紋狀：膜疊放導致抗體殘留，改用單張平鋪洗膜

• 信號衰減快：發光液pH 掉到8 以下，換新鮮底物

• 熒光淬滅快：膜干透，重新水化再成像