雙基因協同永生化設計

SV40大T抗原封閉p53/Rb檢查點，hTERT持續延伸端粒。二者通過P2A自剪切肽構建單開放讀碼框，摩爾表達比鎖定1∶1。該比例下細胞在P30代端粒長度仍維持12–15 kb，與原代差距<5%，避免危機期凋亡。

啟動子組合：CAG與Tet-On 3G的雙重保險

CAG啟動子驅動SV40-hTERT基礎表達，Tet-On 3G系統接入可誘導關閉。加入100 ng/mL多西環素，48 h內hTERT mRNA下降>95%，細胞進入生長停滯。該開關用于研究血管生成基因時排除永生化背景干擾。

微血管表型維護：剪切力與基質膠

生理層流剪切力12 dyn/cm2連續作用24 h，細胞排列指數（orientation index）由0.25升至0.85，接近體內狀態。基質膠濃度3 mg/mL時管腔形成完整，降至1 mg/mL出現斷裂。剪切力缺失48 h，VE-cadherin膜定位消失30%，提示表型漂移。

代謝重編程：糖酵解與OXPHOS實時監測

海馬力細胞能量儀顯示，永生化細胞糖酵解潛能（ECAR）比原代高1.8倍，ATP生成依賴線粒體呼吸比例降至42%。添加2-DG 5 mM后增殖率下降55%，證實其依賴糖酵解維持快速增殖。

基因編輯效率：CRISPR-Cas9最佳窗口

MOI 0.3的lentiCas9-Blast感染48 h后，嘌呤霉素篩選3天即可>97%陽性。編輯位點選擇內源Tie2基因外顯子3，sgRNA spacer 20 nt GC含量55%，插入/缺失效率達78%。編輯后細胞保持微血管屏障功能，TEER值僅下降8%。

免疫逃逸檢測：MHC I表達與NK殺傷

永生化后MHC I表達量下調至原代的35%，NK細胞殺傷率升至45%。補回IFN-γ 100 U/mL可恢復MHC I至70%，NK殺傷率降至20%。該特性用于構建同種異體移植血管化模型。

體外屏障功能：FITC-dextran滲透系數

標準檢測采用4 kDa FITC-dextran，37 ℃ 90 min后基底側熒光強度<5%視為合格。永生化細胞滲透系數（Papp）1.2×10?? cm/s，與原代差距<10%，符合BBB體外模型替代標準。

凍存復蘇端粒檢測

凍存液配方：90% K-SR + 10% DMSO，程序降溫-1 ℃/min。復蘇24 h后qPCR檢測端粒長度，數據需落在12–15 kb區間，偏差>1.5 kb視為批次異常，整批下架。