1. 背景條帶從哪來

WB 膜上一片灰，最常被忽略的是小鼠 IgG 污染。細(xì)胞上清里殘留的小鼠單抗，在膠里電泳后分子量恰好落在 25–55 kDa，與山羊抗小鼠 IgG 二抗結(jié)合，形成“幽靈條帶"。A21210 自帶 HRP，信號放大后灰度值能沖到 40–60，與目標(biāo)條帶 80–120 重疊，肉眼難辨。

2. 封閉液升級：從 5% 脫脂奶到 10% 山羊血清

脫脂奶里含有牛 IgG，A21210 對其交叉 <1%，但奶中生物素會與 HRP 體系產(chǎn)生級聯(lián)背景。把封閉液換成 10% 山羊血清，37 °C 封閉 45 min，背景灰度能降到 10 以下。血清需熱滅活 56 °C 30 min，滅活補(bǔ)體，避免非特異結(jié)合。

3. 一抗稀釋液加“競爭 IgG"

把純化小鼠 IgG 干粉直接摻進(jìn)一抗稀釋液，終濃度 10 μg/mL。游離 IgG 搶占 A21210 的交叉位點(diǎn)，膜上殘留的小鼠 IgG 被“稀釋"成少數(shù)派，信號比從 1:1 拉到 1:20，背景條帶肉眼消失。成本 2 元/片，比換超敏底物便宜 10 倍。

4. 二抗?jié)舛取把鼣?實(shí)驗(yàn)

A21210 推薦 1:5000，出現(xiàn)背景時(shí)直接砍到 1:15000，4 °C 孵育過夜。低溫減緩 HRP 酶促動力學(xué)，信噪比提升 2.3 倍。條帶強(qiáng)度下降 15%，用 CCD 曝光 30 s 補(bǔ)回，不影響定量線性。室溫孵育 1 h 的老辦法在 1:15000 濃度下幾乎無信號，溫度是隱形變量。

5. 膜類型決定“救"還是“棄"

0.45 μm PVDF 孔徑大，IgG 吸附更深，背景難降。換 0.2 μm NC 膜，背景灰度直接掉 30%，但小分子 <20 kDa 會穿膜。實(shí)驗(yàn)若檢測 15 kDa 蛋白，改用 0.22 μm 尼龍膜，甲醇活化步驟省略，A21210 的 HRP 活性保留 98%，背景依舊低。

6. 底物選擇：ECL vs 超敏

ECL 底物在 1 ng 目標(biāo)條帶時(shí)信噪比 3:1，超敏底物可到 10:1，但會把背景一起放大。背景灰度 20 以下用超敏，20 以上先用 ECL 把系統(tǒng)“洗"干凈，再決定要不要升級。A21210 的 HRP 標(biāo)記密度 1.2 mol/mol，足夠驅(qū)動 ECL，無需額外濃縮。

7. 儀器參數(shù)：CCD 增益與像素合并

背景高時(shí)，把 CCD 增益從 10 降到 3，像素合并 2×2，曝光 60 s。信號積分不變，隨機(jī)噪點(diǎn)下降 40%，背景條帶被算法平滑掉。很多實(shí)驗(yàn)室只調(diào)曝光時(shí)間，忽略增益，結(jié)果把背景一起提亮。

8. 數(shù)據(jù)挽救：背景扣減的“紅線"

ImageJ  rolling ball 半徑設(shè) 50 像素，能扣掉大部分背景，但半徑 >75 會把目標(biāo)條帶削薄 10%。真背景來自 IgG 污染，扣減后仍殘留 5% 假陽性。最佳做法是重做實(shí)驗(yàn)，而不是靠軟件“美顏"。