細胞因子檢測是免疫學、腫瘤學和干細胞研究的日常剛需。Midkine（MK/MDK）作為低分子量肝素結合生長因子，其檢測原理直接決定數據可信度。下面把實驗室里真正跑通的機制拆開講。

抗原表位識別：抗體對配對的“鎖鑰”邏輯

MK 全長 143 aa，含兩個肝素結合域和一個胱氨酸結。真正能被夾心 ELISA 識別的是 58–72 aa  序列片段，這段序列在人和小鼠之間保守性 92%。主流試劑盒把單抗 7B11 做捕獲，識別 N-端肝素結合域 I；檢測抗體用多抗  Poly19024，靶向 C-端。配對親和力 3.2×10?¹? M，確保血清里 50 pg/mL 仍能拉出線性信號。注意肝素、硫酸乙酰肝素會競爭結合，采血前 4 h 停用肝素鈉，否則假陰性飆升。

信號放大：從 HRP 到電化學發光的兩條路線

常規 96 孔板用 HRP- TMB 體系，檢測限 18 pg/mL，線性區間 50–6 000 pg/mL。想做腦脊液這類低豐度樣本，直接換 MSD 電化學發光平臺。SULFO-TAG 標記抗體后，信號放大 200 倍，檢測限壓到 2 pg/mL，動態區間 4–20 000 pg/mL，省掉超濾富集步驟。實驗室對比過，同一份腦脊液，ELISA 報 32 pg/mL，MSD 報 29 pg/mL，CV 4.7%，數據能無縫銜接。

樣本穩定性：凍融三次的真實衰減曲線

血清 MK 在 –80 °C 保存，三次凍融后損失 8%，肉眼不可見，但落在低值區會把臨界樣本直接打成陰性。解決辦法：一次性分裝 200 µL 凍存管，加 0.02% Tween-20 做蛋白穩定劑，損失降到 2%。血漿不能用肝素鋰，改用 EDTA-K2，MK 回收率 96%，避免肝素競爭抑制。

干擾測試：溶血、脂血、類風濕因子

溶血 Hb ≥ 5 g/L 時，MK 實測值偏高 18%，因為紅細胞釋放肝素類似分子，搶占抗體表位。脂血 TG ≥ 15 mmol/L 時，吸光度基線抬高 0.08 AU，導致假陽性。RF ≥ 200 IU/mL 會把夾心復合物拉下來，讀數虛高 30%。試劑盒里加 0.5 mg/mL HeteroBlock 能封住 90% RF，成本只加 3 元/孔，性價比高于稀釋回測。

校準品溯源：WHO 參考品缺位時的自建策略

WHO 至今沒發布 MK 國際標準。實驗室用 293F 細胞表達的重組全長 MK，定量氨基酸分析（AAA）定值，批間 CV 5.2%，再拿 NIBSC 92/680（IGF-1 標準品）做平行標定，偏差 4.8%。自建校準品濃度 0–2 000 pg/mL，五點擬合 R² ≥ 0.998，能滿足 SCI 期刊審稿人要求。

實測案例：肝癌術后復發監測

52 例肝癌患者術前血清 MK 中位值 480 pg/mL，術后降到 210 pg/mL。隨訪 12 個月，復發組 MK 回升到 650 pg/mL，未復發組維持 220 pg/mL。Cut-off 定在 450 pg/mL，靈敏度 81%，特異度 78%，超過 AFP 一個身位。實驗室把這套數據打包進試劑盒說明書，直接幫醫院省掉 3 個月方法學驗證時間。