細(xì)胞來(lái)源與組織定位

原代細(xì)胞取自 18–25 歲男性枕部毛囊生長(zhǎng)期組織，顯微解剖后剝離外毛根鞘，保留緊貼真皮乳頭的基質(zhì)區(qū)。每根完整毛囊可分離 1.2–1.8 × 10? 個(gè)基質(zhì)細(xì)胞，CD200?/CD34?/KRT15? 純度≥92%。SV40 Large T 抗原通過(guò)慢病毒 MOI 3 感染，嘌呤霉素 2 μg mL?1 篩選 7 d，獲得永生化株 HFDPC-SV40-IM。

基因組整合位點(diǎn)

全基因組測(cè)序顯示 SV40 片段主要插入 7q21.2 與 12q14.1 兩處。7q21.2 插入破壞 SLC25A37 內(nèi)含子，細(xì)胞對(duì)鐵離子螯合劑 deferoxamine 敏感性下降 40%。12q14.1 插入位于 HMGA2 下游 12 kb，導(dǎo)致 HMGA2 表達(dá)提升 3.8 倍，與核型穩(wěn)定性降低直接相關(guān)。熒光原位雜交探針 SV40-FISH 提供批次報(bào)告，定位偏差>2 Mb 視為不合格。

倍增動(dòng)力學(xué)

37 ℃、5 % CO?、低氧 5 % O? 條件下，倍增時(shí)間 28–31 h；常氧 21 % O? 條件下延長(zhǎng)至 42–45 h。P5–P20 維持線性增長(zhǎng)，群體倍增水平 PDL≈38。超過(guò) P25 出現(xiàn)倍增時(shí)間漂移，每 5 代延長(zhǎng) 4–6 h。凍存復(fù)蘇存活率 85 ± 5 %，臺(tái)盼藍(lán)排除法測(cè)定。

表面標(biāo)志物表達(dá)量

流式十色面板定量：CD49f 97.2 %，CD200 94.8 %，Nestin 89.5 %，α-SMA 1.2 %。黑色素標(biāo)記 MITF 與 TYRP1 陰性（<0.5 %），確保無(wú)外根鞘黑色素細(xì)胞污染。β-catenin 核轉(zhuǎn)位率 45 %，提示 Wnt 通路基線活性高，適用于毛發(fā)生長(zhǎng)激活劑篩選。

生長(zhǎng)因子需求

基礎(chǔ)培養(yǎng)基選用 DMEM/F12（1:1）+ 2 % FBS + 1× ITS-X + 10 ng mL?1 FGF-2 + 5 ng mL?1 EGF + 0.25 μg mL?1 hydrocortisone。FBS 批次差異>10 % 即導(dǎo)致聚團(tuán)率上升；每批需做 48 h 貼壁率預(yù)實(shí)驗(yàn)。FGF-2 采用無(wú)動(dòng)物源重組蛋白，避免 bFGF 抗體污染。

凍存液配方

90 % FBS + 10 % DMSO，含 1× ROCK 抑制劑 Y-27632 5 μM。梯度降溫盒 -1 ℃ min?1 至 -80 ℃，次日轉(zhuǎn)入液氮。復(fù)蘇后 4 h 貼壁率≥80 % 視為合格。長(zhǎng)期存儲(chǔ)超過(guò) 24 個(gè)月需復(fù)檢復(fù)蘇存活率，低于 75 % 判定為失效。

支原體與病毒檢測(cè)

每批次出貨附帶：支原體 qPCR（Ct≥35），SV40 VLP 抗體中和實(shí)驗(yàn)（抑制率≥90 %），HIV/乙肝/丙肝/HPV 多重 PCR 陰性報(bào)告。接收后實(shí)驗(yàn)室需 48 h 內(nèi)復(fù)檢支原體，陽(yáng)性無(wú)條件退換。

STR 指紋與交叉污染

16 位點(diǎn) STR 圖譜與 ATCC 原始記錄差異<5 %。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部交叉污染通過(guò)性別位點(diǎn) Amelogenin 與 Penta E 高頻突變位點(diǎn)比對(duì)，確保與其他人源細(xì)胞無(wú)重疊。

儲(chǔ)存與運(yùn)輸條件

干冰運(yùn)輸 48 h 溫控記錄，全程 -65 ℃ 以下。到貨 30 min 內(nèi)轉(zhuǎn)入液氮，延遲超過(guò) 2 h 存活率下降 10 %。隨貨附帶可溯源二維碼，掃碼即得完整 COA 與測(cè)序原始數(shù)據(jù)。